Ana sayfa Bilim Son Yılların Gözdesi: CRISPR Cas9 Yöntemine Genel Bakış

Son Yılların Gözdesi: CRISPR Cas9 Yöntemine Genel Bakış

Okuma süresi: 4 dakika

Bir çoğumuzun popüler dergiler, sosyal medya ve çevremizden duyduğu bu yöntem, bugüne kadar biyoloji ve moleküler biyoloji alanlarında PCR teknolojisinden sonra gerçekleştirilmiş en önemli çalışmalardan biridir. Kısaca tarihi gelişimine bakılacak olursa;

Görsel1. CRISPR : Gen Düzenleme Yöntemi

CRISPR “Clustered Regularly Interspaced Short Palindomic Repeat” (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar dizileri) ilk olarak 1987’de E.Coli‘nin genomunda keşfedilmiştir. Ancak bu yeni keşifin bakteriyofajlara karşı bir koruyucu işlevi olduğu 2007’ye kadar tam manasıyla anlaşılamadı. İlk deneyler, yoğurt ve peynir üretimi için önemli bir bakteri olan S. thermophilus‘u, eksojen faj DNA’sının bakteri genomuna CRISPR tekrarlarının bir parçası olarak dâhil edilebileceğini test etmek amacıyla yırtıcı fajlara maruz bırakıldı. Polimeraz, nükleaz ve helikazı kodlayan Cas (CRISPR ilişkili) genler bu süreçteki çeşitli rollerini belirlemek için bozuldu. Bilim insanları prokaryotların bir uyarlayıcı bağışıklık sistemi geliştirdiği hipotezini kurdu, bu durum çeşitli Cas genlerini kullanarak sadece istila eden fajların kaydını tutmakla kalmaz aynı zamanda tekrar maruz bırakıldığında fajın yok edilmesini sağlar. Daha belirli bir biçimde, özelleşmiş Cas proteinleri, yabancı DNA’yı yaklaşık 30 baz çifti uzunluğunda küçük parçalara sokar ve bunları CRISPR dizisine yapıştırır (Bu kısma ileride detaylıca anlıtacaktır). Bugün hızla ilerleyen CRISPR çalışmalarında çeşitli tipler doğmuştur bunlardan en yaygın ve bilineni Tip II dir. Tip II CRISPR / Cas sisteminden sonra en son  2015 yılında V. tipi keşfedilmiştir. 

CRISPR VE DÜNYA

CRISPR’ın başarıları gün geçtikçe arttığının bariz kanıtları olarak gösterebileceğimiz bir çok bilimsel haber değeri taşıyan makaleleri bulmak mümkün. CRISPR yönetemi ile geliştirilen ve en yaygın olarak bilinen tedavi yöntemi CAR-T hücre tedavisi uzun zamandır araştırmacılar bu yöntemi kullanarak büyük başarılara imza attılar. Araştırmacılar  özellikle kendilerine tedavisi zor olan hedefler seçmeye özen gösterdiler, örneğin ”Akut Lenfoblastik Lösemi” (ALL) hastalarının kritik dönemde olan bireyleri üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bunlardan en dikkat çekeni; Dr. Grupp, tekrarlayan veya mevcut tedavilere cevap vermeyen TÜM‘li çocuklarda ve genç yetişkinlerde CAR T hücrelerinin çeşitli denemelerini gerçekleştirmiştir. CD19 hedefli CAR T hücrelerini kullanılan  daha önceki denemelerden birinde, çalışmada tedavi edilen 30 hastanın 27’sinde tüm kanser bulguları kayboldu (tam bir yanıt verdi) ve bu hastaların birçoğunun tedaviden sonra tekrarlama belirtileri göstermediği de rapor edilmiştir. Ayrıca son dönemlerde nadir hastalıklar ve parkinson, alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarla alakalı çalışmalara da hız verilmiştir.

CRISPR-Cas9 Gen Düzenleme

Bu kısma giriş yapmadan yazının içerisinde kullanacağımız teknik terimler için küçük bir sözlük hazırlamak makul olacaktır.

Cas (CRISPR Associated Protein):  CRISPR Bağımlı Protein, Cas9 nükleazı Tip II CRISPR sistemindeki aktif bir enzimdir.

gRNA:   Rehber DNA, sentetik olarak endojen bakteriyel tracrRNA ve crRNA’nın birleştirilmiş formu; Hem Cas9 nükleazın iskele kurup/bağlanmasını hem de istenen DNA’nın hedeflenme spesifitesini sağlar; Doğal olarak bulunmaz; Tek rehber DNA (single guide RNA) ya da ‘sgRNA’ olarak da isimlendirilir.

PAM (Protospacer Adjacent Motif):  Cas9’un hedef DNA’ya bağlanması için gerekli; Hedef diziden hemen sonra olmak zorunda.

sgRNA:  Rehber DNA; Sentetik olarak, endojen bakteriyel tracrRNA ve crRNA’dan elde edilen hedefleme ve iskele dizisinin birleştirilmiş formu; Genom mühendisliği
çalışmalarında, Cas9’un spesifik genomik lokusu hedeflemesinde kullanılır; ‘gRNA’ olarak da isimlendirilir.

CRISPR-Cas9 sisteminin Tip II çalışmalarının temel prensibini görseller ile desteklemek en idealidir. Bakteriler son derece olumsuz koşullara adapte olabilmiş ve bulundukları habitat içeresinde egemenlikleri milyonlarca yıl sürdürebilmişlerdir. Bakteriler bu egemenliklerini bazı adaptasyonlara borçludurlar; reseptör mutasyonu, restriksiyon modifikasyonu gibi çok sayıda doğal bağışıklık benzeri sistemlerinin yanında, son olarak spesifik ve dış kaynaklı genetik elementlere karşı kazanılmış bağışıklığı sağlayan CRISPR-Cas adaptif bağışıklık (immün) sistemi tanımlanmıştır. Bakteriler üzerinde yapılan bu çalışmalar in vitro koşullarda CRİSPR yönteminin kabulü için ön ayak olmuştur (2007).  CRISPR’ın görev tanımını yapacak olursak en kaba şekilde şöyle diyebiliriz;

“DNA dizisi üzerinde belli polindromik baz çiftlerinin kesilip-çıkartılıp yerlerine istenilen bazlar yerleştirilerek DNA üzerinde istekli şekilde değişiklikler yapılmasıdır. Mevcut yöntemi uygulayabilmeniz için ihtiyacınız olan şeyler CRISPR kit ve DNA”

Yapılan çalışmalarda, CRISPR Tip II sistemi için gerekli olan en az üç bileşen olduğu bildirilmiştir (Cas9, matür crRNA, tracrRNA). CRISPR aktivitesi için genellikle CRISPR dizilerine bitişik bulunan ve immün yanıt için proteinleri kodlayan CRISPR ilişkili (Cas) genlerin varlığına ihtiyaç vardır.  Bu karakteristik CRISPR dizileri yabancı genetik materyalin kısa segmentlerinden türevlenen tekrarlanmayan sekansların tekrarlayan sekanslar içerisine girmesi ile oluşur. Yani bakteriyi enfekte eden virüs DNA’sının belirli kısımları tekrar genleriyle birlikte CRISPR bölgesine yerleştirilir.

CRISPR-Cas bağışıklık sistemi hücre içerisinde immüniteyi üç adımda gerçekleştirir
(Bakteriofaj anlatımı) ;

OKLAR İLE BİRLİKTE ADIMLARI TAKİP EDİNİZ.

1.ADIM

  • İlk adım, ekzojen (virüs) nükleik asitten elde edilen aralık kısımların CRISPR bölgesine yerleştirildiği adaptasyondur.
  • Bu adımda, protoaralıkların seçimi, istilacı plazmid ve faj genomlarında bulunan protoaralık bitişik motiflerin (protospacer adjacent motif- PAM) spesifik tanınması ile belirlenir.
  • PAM’lar 2-5 nükleotitten oluşan, yüksek korunmuş dizi motifleridir.
  • PAM sekansına sahip yabancı DNA aralık kısmı, tekrarlayan genlerle birlikte CRISPR bölgesine yerleştirilir.
  • Bakteriyel CRISPR bölgesindeki tekrarlar içindeki PAM tanıma dizilerinin eksikliği CRISPR-Cas sistemlerinin kendini hedefleme ve kendini kesme olasılığını ortadan kaldırırken PAM dizilerindeki mutasyonlar fajın CRISPR bağışıklığından kaçmasına izin vermektedir.

Bu adımların daha iyi anlaşılabilmesi için aynı zamanda birde küçük bir benzetme yapacağım; Bu şemadaki atmosferi bir Amerikan kasabasına benzetelim. Bu kasabanın suçluları ve birde polisleri olsun. Suçluların amacı kasabaya girip illegal işler gerçekleştirmek. Burada suçlular fajın DNA’sı ve polisler ise Cas enzimleridir. Kasabaya giren suçluların bir kısmını 1.aşamada bu polisler yakalıyor ve diğer suçlularında eşkallerini merkeze ( Cas gen dizileri ) bildiriyorlar.

2. ADIM

  • İkinci adımda, istilacı DNA’daki hedef sekansın CRISPR lokusuna sokulduğu bölge, öncül CRISPR RNA’lara (pre-crRNA) transkribe edilir ve oluşan pre-crRNA transkriptleri Cas endoribonükleazlar tarafından ekzojen DNA hedef sekanslarıyla Watson-Crick baz eşleşmesi gösteren küçük crRNA’lara dönüştürülür (crRNA’nın sekansı istilacı DNA’nın sekansına karşılık gelir)
  • Bu aşamada faj DNA sı ve CRISPR sekansı birleşerek transkripsiyon geçirip yeni bir dizi oluştururlar.

2.adımda kasabada işler kontrole alınmaya başlıyor (Cas II) ve kasabanın her yerine suçluların fotoğrafları ve suçlarını belirten kağıtlar dağıtılıyor (işlenmiş crRNA).

3. ADIM

  • Son adım ise hedefleme olup, bu adımda, crRNA ile Watson-Crick baz eşleşmesinden yararlanılarak istilacı nükleik asitler hedeflenir, Cas nükleazlar ile homolog sekanslar kesilerek virüslerin ve plazmidlerin çoğalması önlenir.

3. adımda kasabanın muhafızları (Cas III) ortamdaki suçluları yakalamak için harekete geçerler ve ortam suçlulardan arındırılır.

İLGİNİZİ ÇEKEBİLİR ; Evrim Geçiren Virüslere Önlem: CRISPR Ve Yeni Nesil Antibiyotikler

CRISPR Popülerite Uğruna Halka Sunulabilecek Bir Teknoloji Değil!

Virüslerin Canına Okuyan Yeni Sistem: CRISPR-gold

İLERİ OKUMALAR; NATURE

-Science is Everything-